多肽药物生物样品分析方法选择的考量
2020-08-05

来源

中国新药杂志 2020 年 第29卷第11期


作者
翟建平,董立厚,向慎思,李黎,葛志强 天津大学化工学院军事科学院军事医学研究院生命组学研究所


摘要
多肽药物具有靶点明确、成药性好等优点,现今已成为新药研究的热点之一。多肽药物具有给药剂量低、结构与内源性多肽高度相似等特点,因此多肽药物在生物样品分析中面临着诸多挑战,尤其在灵敏度和选择性等方面。本文收集整理了近年来已上市或在研多肽药物的生物样品分析方法,为后续研究者在选择其分析方法时提供参考。


关键词
多肽药物; 生物样品分析; 液相色谱-串联质谱法; 配体结合分析法


正文

多肽药物按照其来源可被分为天然多肽和功能性肽及类似物,具有活性高、用量少、特异性强、不良反应少等特点[1],已广泛应用于临床多个领域,如糖尿病、抗感染、肿瘤以及心血管疾病等。

目前,已有大量的多肽药物经FDA 或者国家药品监督管理局批准上市,其中天然多肽包含催产素( oxytocin) 、血管升压素( vasopressin) 、艾塞那肽( exenatide) 、甲状旁腺激素( parathyroid hormone) 、降钙素( calcitonin) 和环孢素( cyclosporin) 等; 功能性肽及类似物包含去氨加压素( desmopressin) 、依替巴肽( eptifibatide) 、亮丙瑞林( leuprolide) 、普兰林肽( pramlintide) 、恩夫韦肽( enfuvirtide) 和奥曲肽( octreotide)等[2 - 3]。

给药剂量低、药效高、结构与内源性多肽高度相似是多肽药物的特点,导致对多肽药物的生物分析提出了更高的要求。多肽药物常用的生物样品分析方法主要有配体结合分析法( ligand binding assay,LBA) 和液相色谱-串联质谱法( liquid chromatogra phy-tandem mass spectrometry,LC-MS /MS) 。

LBA 作为分析多肽药物的最常用方法,是基于抗体对分析物/抗原的特异性识别来进行定量分析目标多肽,主要包括酶联免疫检测法( enzyme-linkedimmunosorbent assay,ELISA) 、放射免疫分析法( radioimmunoassay,RIA) 、电化学发光( meso scale discovery,MSD) 等。ELISA 与其他检测方法相比,具有成本低、操作简单、快速、灵敏度高、通量大、无放射性危害等优点。但是,LBA 应用于多肽药物分析也呈现出一些不足,如特异性试剂的制备困难且价格高昂,无法排除内源性类似物及其代谢物的干扰等。

随着技术手段的进步,LC-MS /MS 技术因具有更高的选择性、分离度、灵敏度及通量大的特点成为多肽药物分析的主要技术手段之一。研究工作者为了更准确地定量目标分析物,将LC-MS /MS 技术与LBA 的免疫亲和捕获相结合形成LBA-LC-MS /MS联用法( hybrid ligand binding with LC-MS /MS,LBLC-MS /MS) 。该方法利用特异性或非特异性试剂将待测物从生物样品中提取、富集后,使用LC-MS /MS 方法测定待测物浓度。该方法因为高效的免疫捕获手段,具有高灵敏度和高选择性等优点。表1是对近年来典型的多肽药物生物样品分析方法进行了整理归纳。


多肽样本生物分析方法举例.png


多肽根据氨基酸残基数目可分: ① 小肽,氨基酸残基数目< 15 个。② 中等肽,氨基酸残基数目在15 ~ 50 个。③ 大肽( 蛋白质) ,氨基酸残基数目在50 个以上[32]。一般将氨基酸残基数目在50 及50 个以下的肽统称为多肽[33]。基于LBA 与LCMS/MS 的特点,本文对多肽药物氨基酸残基数及是否有干扰的代谢物存在的情况进行综述,为研究工作者选择合适的方法来定量生物样品中多肽药物浓度提供参考。


1. 根据所含氨基酸数目选择分析平台


1. 1 小肽

小肽抗原性较弱,不易产生抗体,很难获得免疫分析法所需要的检测分析的试剂,因此常采用LCMS/MS 法来进行定量分析。小肽的理化性质介于小分子化药和大分子蛋白质之间,需要根据小肽的理化性质来选择合适的前处理方法。小肽的生物样品前处理方法主要有: 蛋白沉淀法、液-液萃取法和固相萃取法。以下是使用LC-MS /MS 作为分析方法来定量的小肽类药物。


1. 1. 1 生长激素释放肽( growth hormone-releasingpeptides,GHRPs) 

GHRPs 是一类刺激垂体和下丘脑释放生长激素的多肽家族,由4 ~ 7 个氨基酸构成。典型上市药物有海沙瑞林( hexarelin) 、伊帕瑞林( ipamorelin) 、艾瑞莫瑞林( alexamorelin) 。Thomas等[34]开发了一种nano UPLC-MS 法,用于检测人尿液中hexarelin,alexamorelin 和ipamorelin 的含量,该方法使用混合型弱阳离子固相萃取柱处理尿液样品,线性范围为10 ~ 500 pg·mL -1,检测限为2 ~ 10 pg·mL -1


1. 1. 2 kahalalide F( KF) 

KF 是一种新型的环状缩酚酸抗癌药物,含13 个氨基酸,分子量为1 478 Da,在体外和体内均显示出抗癌活性,尤其对人前列腺癌细胞系的抑制增殖活性。但KF 抗体不易获得,无法建立LBA 的检测方法。Stokvis 等[35]开发并验证LC-ESI-MS /MS 定量分析人血浆中KF 浓度的方法。该方法采用Bond Elut C18固相萃取小柱处理血浆样品,其线性范围为1 ~ 1 000 ng·mL -1,定量下限( LLOQ) 为1 ng·mL -1,批内准确度在- 2. 68% ~- 9. 05%,批间精密度为9. 91%。


1. 1. 3 亮丙瑞林

亮丙瑞林是由9 个氨基酸构成的强效促性腺激素释放激素激动药,主要治疗前列腺癌、宫内膜异位症、子宫肌瘤等激素依赖性肿瘤。亮丙瑞林的抗体制备耗时较长,且不易获得高亲和力的抗体,建立LBA 的检测方法比较困难。翟南南等[36]采用LC-MS /MS 法测定人血清中亮丙瑞林浓度,使用蛋白沉淀法处理人血清样品,该方法操作简单、快速,方法学验证结果表明内源性物质不干扰血清样品的测定。童强等[8]开发并验证了使用LCMS/MS 定量分析大鼠血浆中亮丙瑞林浓度的方法。该方法选择固相萃取法作为前处理方法,线性范围为0. 02 ~ 100 ng·mL -1,定量下限为0. 02 ng·mL -1

综上所述,由于合适的小肽抗体不易被制备,很难建立相应的LBA 检测方法。根据小肽的理化性质建立适用的LC-MS /MS 法,用于定量测定生物样品中的小肽浓度。LC-MS /MS 法具有高选择性、宽的线性范围、直接检测小肽自身等优点,可作为检测小肽的首选方法。


1. 2 中等肽

LBA 和LC-MS /MS 法是常用于定量分析中等肽的方法。检测方法的选择主要受多种因素的影响,如中等肽是否为内源性多肽、抗体获得难易程度、分析方法开发时间、样品前处理时间及灵敏度要求等。


1. 2. 1 胸腺素α1 ( thymosin α1,Tα1) 

Tα1 是由Goldstein 从牛胸腺中分离出来的具有28 个氨基酸残基的酸性多肽,是临床上治疗免疫缺陷病、肿瘤和感染等的辅助药物。Weller 等[14]建立了一种不需要放射性碘标记的、用于测定人血清Tα1 的ELISA法。该方法采用抗体夹心法对Tα1 进行定量检测,检测限为100 pg·mL -1。Tuthill 等[12]采用LC-MS /MS 法测定人血清中Tα1 浓度。通过固相萃取和RP-LC-MS /MS 测定人血清中的Tα1,线性范围为0. 5 ~ 100 ng·mL -1,定量下限为0. 5 ng·mL -1


1. 2. 2 利拉鲁肽

利拉鲁肽由31 个氨基酸组成( 见图1) [37],分子量为3 751 Da。利拉鲁肽具有控制血糖、减轻体重及促进胰岛素分泌等作用,主要用于治疗2 型糖尿病。2002 年,Agers 等[17] 采用ELISA 法对利拉鲁肽进行定量,并首次将其应用于药动学( pharmacokinetic,PK) 研究。由于利拉鲁肽的抗体制备成本较高,故Dong 等[15] 建立了一种LC-MS /MS 法,用于定量分析大鼠血浆中利拉鲁肽浓度。该方法采用蛋白沉淀作为前处理方法,线性范围为0. 5 ~ 250 ng·mL -1


利拉鲁肽分子结构图.png


1. 2. 3 人胰岛素( human insulin) 

人胰岛素由A,B 2 条链构成,含51 个氨基酸,分子量为5 784 Da。它主要用于治疗胰岛素依赖型糖尿病( 1 型糖尿病)和非胰岛素依赖型糖尿病( 2 型糖尿病) 。陈超等[28]建立了一种化学发光免疫法( chemiluminescentimmunoassay,CLIA) ,用于定量人血清中胰岛素的浓度。该方法的线性范围为0. 08 ~ 300 μIU·mL -1,检测下限为0. 08 μIU·mL -1。胰岛素属于内源性物质,在使用免疫学方法定量分析同工胰岛素时,会与体内的内源胰岛素交叉反应,测得值是总的胰岛素浓度。为此,Dong 等[26]开发并验证了一种LC-MS /MS 定量比格犬血浆中人胰岛素浓度的方法。该方法线性范围为1 ~ 1 000 μIU·mL-1,定量下限为1μIU·mL -1( 38. 46 pg·mL -1) 。

从上述实例中发现,易制备获得特异性抗体的中等肽,LBA 法可以获得高灵敏度,可作为首选的分析方法。不易获得抗体或者使用LBA 法检测过程中易受到内源性物质干扰的多肽,采用LC-MS /MS 法进行生物样品分析是首选。LC-MS /MS 法具有高选择性、方法开发时间短等优点。另外,如果上述2 种方法单独使用均不能建立一种准确灵敏的分析方法时,可以考虑LB-LC-MS /MS 法即采用抗体捕获后对生物样品进行纯化和富集后再用质谱进行定量分析,可以获得高灵敏度、高选择性的生物样品分析方法。以上定量分析方法各具优缺点,可以根实际需求来选择合适的分析方法,用于定量生物样品中中等肽的浓度。


1. 3 大肽

大肽分子量较大、抗原性较强、易产生特异性抗体,LBA 法具有高灵敏度与高通量等优点,是定量大肽的常用检测方法。邵继平等[38]采用双抗体夹心法对食蟹猴血浆中重组人钙调磷酸酶B 亚基( rh-CNB) 多肽进行定量分析,该方法灵敏度较高,线性范围为0. 195 ~ 12. 5 ng·mL -1。Li 等[39]采用ELISA法测定人血清中重组人甲状旁腺激素( rhPTH 1-84)的浓度,研究结果表明rhPTH 1-84 具有良好的安全性和PK 特征。LBA 法在定量研究中往往存在交叉反应,从而影响真实测定结果。为解决该问题,可以采用免疫捕获纯化作为前处理方法,LC-MS /MS 技术作为检测手段,来定量分析生物基质中的大肽浓度。Kumar 等[40]使用聚丙乙烯珠免疫捕获纯化人血清中的PTH 1-84,并用胰蛋白酶消化PTH 1-84 产生N 末端PTH 1-13 的方法进行LC-MS /MS 定量分析。该方法的线性范围为39. 1 ~ 4 560 ng·L-1。该方法验证结果表明,与免疫测定法相比LC-MS /MS法具有更好的灵敏度。2 根据代谢物干扰情况选择分析平台生物样品中的多肽药物传统上通过免疫学方法定量。这些方法具有选择性不足等缺点,通常不能对肽与其衍生物或降解片段进行有效的区分。而LC-MS /MS 将高效液相色谱( HPLC) 的高分离度与质谱( MS) 的高选择性结合在一起。使得LC-MS /MS 可以同时分析多种物质,即目标药物及其代谢物。


2. 根据代谢物干扰情况选择分析平台


生物样品中的多肽药物传统上通过免疫学方法定量。这些方法具有选择性不足等缺点,通常不能对肽与其衍生物或降解片段进行有效的区分。而LC-MS /MS 将高效液相色谱( HPLC) 的高分离度与质谱( MS) 的高选择性结合在一起。使得LC-MS /MS 可以同时分析多种物质,即目标药物及其代谢物。


2. 1 特立帕肽( teriparatide,PTH 1-34)

PTH 1-34 是天然内源性甲状旁腺激素( PTH1-84) 的生物活性N-末端片段,主要用于治疗骨折高风险患者的骨质疏松症。PTH 1-34 可能在体内发生蛋白水解,Eugster 等[21]验证了超高压液相色谱串联质谱( UHPLC-MS /MS) 方法,该方法可在亚微摩尔水平上测定完整的PTH 1-34,线性范围为0. 4 ~51. 2 pmol·L -1,定量下限为0. 4 pmol·L -1。经UHPLC-MS /MS 检测发现,PTH 1-34 半衰期较短,ELISA检测出的结果均高估了PTH 1-34 的终末段浓度。通过定性质谱分析,功能未知的PTH 1-34 片段PTH 1-33 被发现。该研究表明,当待测物在体内代谢成具有其他生物活性的片段时,相较于免疫测定LC-MS /MS 技术能准确区分待测物及其代谢产物。


2. 2 胰高血糖素样肽1 ( glucagon-like peptide-1,GLP-1)

GLP-1 是肠黏膜中的内分泌细胞受营养物质刺激而分泌的一种肠促胰岛素。GLP-1 是葡萄糖稳态的有效调节剂,可以增强葡萄糖依赖性胰岛素分泌。GLP-1 在人血浆中以非常低的浓度( < 10 pmol·L -1 ) 存在,是半衰期非常短的疏水性肽。在体内,活性的GLP-1 被二肽基肽酶IV( DPP-IV) 快速裂解成无活性的GLP-1[41]。对于GLP-1 活性与非活性的降解产物的检测分析,Bak 等[42]采用MSD 技术检测buffer 和血浆样品中的6 种GLP-1 亚型( GLP-1 1-36NH2,7-36NH2,9-36NH2,1-37,7-37 和9-37) ,其结果显示,buffer 和血浆样品中的6 种GLP-1 亚型均被MSD GLP-1 总浓度的试剂盒检测到,但非活性GLP-1 的回收率较低,尤其在血浆样品中。由于胰高血糖素原生物学的复杂性,目前有一些基于免疫的检测方法的选择性常常受到质疑。为此,Chappell等[41]使用免疫亲和LC-MS /MS( IA LC-MS /MS) 定量人血浆样品中内源活性的GLP-1( 7-36) 和无活性的GLP-1( 9-36) 的方法。该方法的线性范围为0. 49 ~360 pmol·L -1


2. 3 甘精胰岛素

甘精胰岛素是由53 个氨基酸构成的重组长效胰岛素类似物( 见图2) [37],分子量为6 063 Da。甘精胰岛素已被FDA 批准用于治疗1 型和2 型糖尿病患者。Xu 等[43]采用RIA 法与LC-MS /MS 法分别对人血浆中甘精胰岛素进行定量分析。其研究结果表明,LC-MS /MS 法克服了RIA 的特异性差的局限性,可以同时定量分析甘精胰岛素及其代谢产物浓度,且不受内源性胰岛素、外源性胰岛素类似物及抗胰岛素抗体等干扰。该方法灵敏度高和耐用性好,成功支持甘精胰岛素的临床研究。崔艳丽等[29]采用固相萃取法处理比格犬血浆样品后,利用LC-MS /MS 法定量血浆样品中甘精胰岛素及其代谢产物的浓度,该方法的线性范围为0. 3 ~ 10 ng·mL -1


甘精胰岛素分子结构图.png


3. 结语

综上所述,在多肽药物生物样品分析中,对于较易获得选择性高、特异性好的抗体试剂,LBA 法有较低的检测限,是分析生物样品的首选方法; 对于不易获得的抗体试剂,LC-MS /MS 法可以满足生物样品分析的定量要求,LC-MS /MS 法是分析生物样品的较优选择; 对于分别采用LBA 法和LC-MS /MS 法都无法对生物样品进行定量分析时,可以考虑采用LB-LC-MS /MS 法。

LB-LC-MS /MS 法通过免疫捕获法对样品进行富集,具有更好的灵敏度和选择性,可作为分析生物样品的优先选择。总之,在选择多肽药物分析平台的时候需要综合考虑目标多肽的分子特点、特异性试剂获取难易程度和检测要求等多个方面因素选择合适的分析平台,从而可以大大缩短方法开发时间。


参考文献

详见 中国新药杂志 2020 年 第29卷第11期